Catalog NO.:BE6868
Applications :
Reactivity :
货号 | 规格 | 品牌 | 库存 | 价格 | 数量 | 操作 |
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BE6868-5ml | 5ml |
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BE6868-1ml | 1ml |
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1.产品简介
rProtein A/G Beads 4FF 是将 rProtein A/G 高密度定向偶联到高度交联的琼脂糖凝胶微球表面,该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率,洗脱条件更均一,一步纯化即可从血清样品中分离出纯度大于 90%的抗体。产品性能见表1。
本产品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究,也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的种属来源及亚型选择微球的类别,Protein A,Protein G 和 Protein A/G 与不同抗体的亲和性比较参见表2。
表 1. rProtein A/G Beads 4FF 产品性能
指标 |
性能 |
基质 |
高度交联的 |
配体 |
重组蛋白A/G |
载量 |
10-15mg 人 lgG/ml 介质 |
粒径 (μm) |
45-165 |
最大压力 |
0.3 MPa ,3 bar |
pH 稳定范围 |
3-10 |
储存缓冲液 |
含20% 乙醇的 1XPBS |
储存温度 |
2°C -8°C |
表 2. Protein A、Protein G 和 Protein A/G 对不同抗体的结合能力
种属 |
亚型 |
Protein A |
Protein G |
Protein A/G |
Human |
IgA |
varible |
— |
++ |
IgD |
— |
— |
— |
|
IgE |
— |
— |
— |
|
IgG1 |
++++ |
++++ |
++++ |
|
IgG2 |
++++ |
++++ |
++++ |
|
IgG3 |
— |
++++ |
++++ |
|
IgG4 |
++++ |
++++ |
++++ |
|
IgM |
varible |
— |
++ |
|
Avian egg yolk |
IgY |
— |
— |
— |
Cow |
|
++ |
++++ |
++++ |
Dog |
|
++++ |
++ |
++++ |
Goat |
|
— |
++++ |
++++ |
Horse |
Total |
IgG |
++ |
++++ |
Monkey(rhesus) |
|
++++ |
++++ |
++++ |
Mouse |
IgG1 |
+ |
++++ |
++ |
|
IgG2a |
++++ |
++++ |
++++ |
|
IgG2b |
+++ |
+++ |
+++ |
|
IgG3 |
++ |
+++ |
+++ |
|
IgM |
variable |
— |
— |
Pig |
|
+++ |
+++ |
++++ |
Rabbit |
Total IgG |
++++ |
+++ |
++++ |
Rat |
IgG1 |
— |
+ |
++ |
|
IgG2a |
— |
++++ |
++++ |
|
IgG2b |
— |
++ |
++ |
|
IgG3 |
+ |
++ |
++ |
++++=结合能力强; ++=结合能力中等; —=结合能力弱或没有结合
纯化流程
本产品主要应用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。
2.1 缓冲液的准备
所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。
平衡/ 洗杂液: 0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0
洗脱液: 0.1M 甘氨酸,pH 3.0
中和液:1M Tris-HCl,pH 8.5
交联液:0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2
交联剂:DMP(dimetyl pimelimidate dihydrochloride)
终止液:50 mM Tris, pH 7.5
2.2 样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值,可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释,或者样品用平衡/洗杂液透析。对于100 mm 培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,使用预冷PBS洗涤一次后加入2ml细胞裂解液裂解细胞。对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。植物或动物组织样品可以使用液氮研磨方法裂解。具体的裂解方法请参考不同裂解液的使用说明,裂解液最终总蛋白浓度选择在 0.5-1μg/μl范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同,需要对总蛋白浓度进行预实验调整。
2.3. 去除非特异性结合(可省略)
1) 取200微升至1毫升蛋白样品,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的Normal IgG和20微升充分重悬的rProtein A/G Beads 4FF,4℃缓慢摇动30分钟。
2) 2500rpm (约1000g)离心1分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。
注:哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG 发生结合,可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用 normal IgG 和 rProtein A/G Beads 4FF 对裂解液预处理可以降低非特异性吸附。
2.4 免疫沉淀操作流程
免疫沉淀直接法操作流程示意图如下:
2.4.1 抗体吸附
1)取适量的 rProtein A/G Beads 4FF 加入到 2ml 离心管中,800rpm 离心 1min,吸弃 上清。
2) 加入 0.5ml 平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋 白的作用),800rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复两次。
3) 向步骤 2) 平衡的填料中加入抗体溶液,悬浮填料,室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,约 30min 后,800rpm 离心 1min,收集上清液,留待检测。
4) 向 3) 的填料中加入 0.5ml 的洗杂液,悬浮填料,进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋 白,800rpm 离心 1min,吸弃上清。再重复两次。
2.4.2 抗体交联 (备选)
如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱,请忽略本步骤,直接进行 2.4.3。50ul-1ml 填料量均可以按照以下步骤操作,无需额外增加交联液体积。
1) 向清洗过的填料中加入1ml 交联液,800rpm离心1min,吸弃上清。
2) 再向其中加入1ml 含20 mM DMP(dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联液,此试剂需要现用现配,悬浮填料,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,促使缓冲液和填料充分接触, 约 30min 后,800rpm 离心1min,吸弃上清。
3) 再向其中加入1ml 终止液,悬浮填料,终止交联反应,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管, 约 15min 后,800rpm 离心 1min,再吸弃上清。
4) 加入0.5ml 的洗杂液,悬浮填料,进行清洗,800rpm 离心1min,吸弃上清。再重复两次。
2.4.3 抗原沉淀反应
1) 抗原吸附:加入含有抗原的样品,用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min,使抗原与抗体充分结合,如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。
2) 洗杂:将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心,800rpm 离心 1min,收 集上清液,置于冰上以备后续检测。向离心管中加入1ml洗杂液,用移液器轻轻吹打使填料-抗体-抗原复合物均匀分散,然后进行离心分离,800rpm 离心 1min,弃上清液。 再重复洗涤两次。最后加入 1ml 洗杂液,用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移至新的1.5 ml离心管中,并进行离心分离,800rpm 离心 1min,弃上清液。
3) 抗原洗脱:提供以下两种抗原洗脱方案,可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
变性洗脱法:此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。向离心管中加入 25μl 1× SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀,95℃ 加热5min。然后进行离心,800rpm 离心 1min,收集上清液,进行 SDS-PAGE 电泳,转膜后进行Western分析。
非变性洗脱法:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。向离心管中加入5倍柱体积的洗脱液,用移液器吹打5次,混匀,然后在室温下置于翻转混合仪或者 手工轻轻翻转离心管,10min后,离心,800rpm 离心 1min,吸取上清液,收集洗脱组分,即为目标抗原,收集上清液至新的离心管中,并立即加入十分之一体积的中和液,将洗脱组分pH调节至7.0-8.0,用于后期功能分析。